Mahalo no ke kipa ʻana iā Nature.com. Loaʻa i ka mana polokalamu kele pūnaewele āu e hoʻohana nei ke kākoʻo palena no CSS. No ka ʻike maikaʻi loa, paipai mākou iā ʻoe e hoʻohana i kahi polokalamu kele pūnaewele i hōʻano hou ʻia (a i ʻole e hoʻopau i ke ʻano hoʻohālikelike ma Internet Explorer). I kēia manawa, no ka hōʻoia ʻana i ke kākoʻo mau ʻana, e hōʻike mākou i ka pūnaewele me ka ʻole o nā kaila a me JavaScript.
Ua loaʻa i nā nanoparticles insulin (NPs) me ka nui o ka hoʻouka ʻana i nā noi like ʻole i nā ʻano dosage like ʻole. Manaʻo kēia hana e loiloi i ka hopena o nā kaʻina hana maloʻo-hau a me ka hoʻomaloʻo-pīpī ma ke ʻano o nā nanoparticles chitosan i hoʻouka ʻia e ka insulin, me ka ʻole o ka mannitol ma ke ʻano he cryoprotectant. Ua loiloi pū mākou i ka maikaʻi o kēia mau nanoparticles ma ka hoʻoheheʻe hou ʻana iā lākou. Ma mua o ka dehydration, ua hoʻonui ʻia ka nui o ka ʻāpana o nā nanoparticles chitosan/sodium tripolyphosphate/insulin cross-linked i 318 nm, ʻo ka PDI he 0.18, ʻo ka pono o ka encapsulation he 99.4%, a ʻo ka hoʻouka ʻana he 25.01%. Ma hope o ka hoʻoponopono hou ʻana, ua mālama nā nanoparticles āpau, koe wale nō nā mea i hana ʻia e kahi ʻano maloʻo-hau me ka ʻole o ka hoʻohana ʻana i ka mannitol, i ko lākou ʻano ʻāpana spherical. Ke hoʻohālikelike ʻia me nā nanoparticles i loaʻa ka mannitol i hoʻomaloʻo ʻia e kekahi spray, ua hōʻike pū nā nanoparticles spray-dried mannitol-free i ka liʻiliʻi loa o ka nui o ka ʻāpana (376 nm) a me ka nui o ka hoʻouka ʻana kiʻekiʻe loa. (25.02%) me ka like o ka helu encapsulation (98.7%) a me PDI (0.20) ma o ka hoʻomaloʻo ʻana a i ʻole nā ​​​​ʻano hana hoʻomaloʻo hau. ʻO nā nanoparticles maloʻo ma o ka hoʻomaloʻo ʻana me ka ʻole o ka mannitol ua hopena pū i ka hoʻokuʻu wikiwiki ʻana o ka insulin a me ka pono kiʻekiʻe loa o ka lawe ʻana o ke kelepona. Hōʻike kēia hana hiki i ka hoʻomaloʻo ʻana ke hoʻomaloʻo i nā nanoparticles insulin me ka ʻole o ka pono no nā cryoprotectants i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻano hoʻomaloʻo hau maʻamau, e hana ana i ka hiki ke hoʻouka nui aʻe, nā koi hoʻohui haʻahaʻa a me nā kumukūʻai hana he pono koʻikoʻi.
Mai kona ʻike ʻia ʻana i ka makahiki 19221,2,3, ua hoʻopakele ka insulin a me kāna mau hoʻomākaukau lāʻau lapaʻau i ke ola o nā poʻe maʻi me ka maʻi diabetes type 1 (T1DM) a me ka maʻi diabetes type 2 (T1DM). Eia nō naʻe, ma muli o kona mau waiwai ma ke ʻano he protein kaumaha molekala kiʻekiʻe, ua maʻalahi ka hōʻuluʻulu ʻana o ka insulin, ua wāwahi ʻia e nā enzymes proteolytic, a ua hoʻopau ʻia e ka hopena mua. Pono nā poʻe i ʻike ʻia me ka maʻi diabetes type 1 i nā inikini insulin no ke koena o ko lākou ola. Pono pū kekahi mau poʻe maʻi he nui i ʻike mua ʻia me ka maʻi diabetes type 2 i nā inikini insulin lōʻihi. ʻO nā inikini insulin i kēlā me kēia lā he kumu koʻikoʻi ia o ka ʻeha a me ka ʻoluʻolu ʻole o kēlā me kēia lā no kēia poʻe, me nā hopena maikaʻi ʻole i ke olakino noʻonoʻo. ʻO ka hopena, ke aʻo nui ʻia nei nā ʻano ʻē aʻe o ka lawelawe ʻana o ka insulin e hoʻemi ai i ka ʻoluʻolu ʻole, e like me ka lawelawe ʻana o ka insulin waha,5 no ka mea he hiki iā lākou ke hoʻihoʻi i ke ʻano o ke ola o kahi 5 biliona poʻe me ka maʻi diabetes ma ka honua holoʻokoʻa.
Ua hāʻawi ka ʻenehana Nanoparticle i kahi holomua koʻikoʻi i nā hoʻāʻo e lawe i ka insulin waha4,6,7.ʻO kahi mea e hoʻopuni pono a pale i ka insulin mai ka hōʻino ʻana no ka lawe ʻana i nā wahi kikoʻī o ke kino.Eia nō naʻe, he nui nā palena o ka hoʻohana ʻana i nā ʻano nanoparticle, ʻo ia hoʻi ma muli o nā pilikia paʻa o nā hoʻokuʻu ʻāpana.Hiki ke hana ʻia kekahi hōʻuluʻulu ʻana i ka wā e mālama ai, kahi e hōʻemi ai i ka bioavailability o nā nanoparticles i hoʻouka ʻia e ka insulin8.Eia kekahi, pono e noʻonoʻo ʻia ke kūpaʻa kemika o ka matrix polymer o nā nanoparticles a me ka insulin e hōʻoia i ke kūpaʻa o nā nanoparticles insulin (NPs).I kēia manawa, ʻo ka ʻenehana hoʻomaloʻo hau ke kūlana gula no ka hana ʻana i nā NP paʻa me ka pale ʻana i nā loli makemake ʻole i ka wā e mālama ai9.
Eia nō naʻe, pono ka hoʻomaloʻo hau i ka hoʻohui ʻana o nā cryoprotectants e pale i ka hoʻopili ʻia ʻana o ke ʻano poepoe o nā NP e ke kaumaha mechanical o nā kristal hau. Hoʻemi nui kēia i ka hoʻouka ʻana o nā nanoparticles insulin ma hope o ka lyophilization, ʻoiai ʻo ka cryoprotectant e noho ana i ka hapa nui o ka lakio kaumaha. No laila, ʻike pinepine ʻia nā NPs insulin i hana ʻia he kūpono ʻole no ka hana ʻana i nā ʻano pauka maloʻo, e like me nā papa waha a me nā kiʻiʻoniʻoni waha, ma muli o ka pono no ka nui o nā nanoparticles maloʻo e hoʻokō ai i ka puka makani therapeutic o ka insulin.
ʻO ka hoʻomaloʻo ʻana i ka pīpī kahi hana ʻoihana kaulana a ʻaʻole pipiʻi no ka hana ʻana i nā pauka maloʻo mai nā ʻano wai i loko o ka ʻoihana lāʻau lapaʻau10,11. ʻO ka kaohi ʻana i ke kaʻina hana hoʻokumu ʻāpana e ʻae ai i ka encapsulation kūpono o kekahi mau pūhui bioactive 12, 13. Eia kekahi, ua lilo ia i ʻenehana kūpono no ka hoʻomākaukau ʻana i nā protein i hoʻopaʻa ʻia no ka lawelawe waha. I ka wā o ka hoʻomaloʻo ʻana i ka pīpī, evaporate koke ka wai, kahi e kōkua ai i ka mālama ʻana i ka mahana o ka ʻōpū o ka ʻāpana haʻahaʻa11,14, e hiki ai i kāna noi ke hoʻopaʻa i nā ʻāpana wela. Ma mua o ka hoʻomaloʻo ʻana i ka pīpī, pono e homogenized maikaʻi ʻia ka mea uhi me ka hopena e loaʻa ana nā mea i hoʻopaʻa ʻia11,14. ʻAʻole e like me ka hoʻomaloʻo hau, ʻo ka homogenization ma mua o ka encapsulation i ka hoʻomaloʻo ʻana i ka pīpī e hoʻomaikaʻi i ka pono o ka encapsulation i ka wā dehydration. ʻOiai ʻaʻole koi ke kaʻina hana encapsulation hoʻomaloʻo i nā cryoprotectants, hiki ke hoʻohana ʻia ka hoʻomaloʻo ʻana i ka pīpī e hana i nā NP maloʻo me ka ʻike ukana kiʻekiʻe.
Hōʻike kēia haʻawina i ka hana ʻana o nā NP i hoʻouka ʻia e ka insulin ma o ke keʻa ʻana o ka chitosan a me ka sodium tripolyphosphate me ka hoʻohana ʻana i kahi ʻano gel ion. ʻO ka gelation Ion kahi ʻano hoʻomākaukau e hiki ai ke hana ʻia nā nanoparticles ma o nā pilina electrostatic ma waena o ʻelua a ʻoi aku paha nā ʻano ionic ma lalo o kekahi mau kūlana. Ua hoʻohana ʻia nā ʻano hana hoʻomaloʻo hau a me ka hoʻomaloʻo pīpī e hoʻomaloʻo i nā nanoparticles i hoʻopili ʻia ʻo chitosan/sodium tripolyphosphate/insulin. Ma hope o ka dehydration, ua kālailai ʻia ko lākou morphology e SEM. Ua loiloi ʻia ko lākou hiki ke hoʻohui hou ʻia ma ke ana ʻana i ko lākou hoʻolaha nui, ka hoʻouka ʻana o ka ʻili, PDI, ka pono o ka encapsulation, a me ka ʻike hoʻouka. Ua loiloi ʻia hoʻi ke ʻano o nā nanoparticles resolubilized i hana ʻia e nā ʻano dehydration like ʻole ma ka hoʻohālikelike ʻana i kā lākou pale ʻana i ka insulin, ke ʻano hoʻokuʻu, a me ka pono o ka lawe ʻana o ke kelepona.
ʻO ka pH o ka hopena i hui ʻia a me ka lakio o ka chitosan a me ka insulin ʻelua mau mea nui e hoʻopilikia i ka nui o ka ʻāpana a me ka pono o ka encapsulation (EE) o nā NP hope loa, ʻoiai lākou e hoʻopilikia pololei ana i ke kaʻina hana gelation ionotropic. Ua hōʻike ʻia ka pH o ka hopena i hui ʻia e pili pono ana me ka nui o ka ʻāpana a me ka pono o ka encapsulation (Kiʻi 1a). E like me ka mea i hōʻike ʻia ma ke Kiʻi 1a, i ka piʻi ʻana o ka pH mai 4.0 a i 6.0, ua emi ka nui o ka ʻāpana awelika (nm) a ua piʻi nui ka EE, ʻoiai i ka piʻi ʻana o ka pH i 6.5, ua hoʻomaka ka nui o ka ʻāpana awelika e piʻi a ua noho mau ka EE. I ka piʻi ʻana o ka lakio o ka chitosan i ka insulin, piʻi pū ka nui o ka ʻāpana awelika. Eia kekahi, ʻaʻohe loli i ka EE i ʻike ʻia i ka wā i hoʻomākaukau ʻia ai nā nanoparticles ma ka lakio nui o ka chitosan/insulin ma mua o 2.5:1 (w/w) (Kiʻi 1b). No laila, ua hoʻohana ʻia nā kūlana hoʻomākaukau kūpono loa ma kēia haʻawina (pH 6.0, lakio nui o ka chitosan/insulin o 2.5:1) e e hoʻomākaukau i nā nanoparticles i hoʻouka ʻia i ka insulin no ke aʻo hou aku. Ma lalo o kēia kūlana hoʻomākaukau, ua hoʻonui ʻia ka nui o ka ʻāpana awelika o nā nanoparticles insulin i 318 nm (Kiʻi 1c), ʻo ka PDI he 0.18, ʻo ka pono o ka hoʻokomo ʻana he 99.4%, ʻo ka zeta potential he 9.8 mv, a ʻo ka hoʻouka ʻana o ka insulin he 25.01% (m/m). Ma muli o nā hopena microscopy electron transmission (TEM), ua ʻano poepoe a ʻokoʻa nā nanoparticles i hoʻonui ʻia me ka nui like (Kiʻi 1d).
Ka hoʻonui ʻana o nā ʻano nanoparticles insulin: (a) ka hopena o ka pH ma ke anawaena awelika a me ka pono o ka encapsulation (EE) o nā nanoparticles insulin (i hoʻomākaukau ʻia ma ka lakio nui 5:1 o ka chitosan a me ka insulin); (b) chitosan a me ka Mana o ka lakio nui o ka insulin ma ke anawaena awelika a me ka pono o ka encapsulation (EE) o nā NP insulin (i hoʻomākaukau ʻia ma ka pH 6); (c) ka hoʻolaha ʻana o ka nui o nā ʻāpana o nā nanoparticles insulin i hoʻomaikaʻi ʻia; (d) TEM micrograph o nā NP insulin i hoʻomaikaʻi ʻia.
Ua ʻike maopopo ʻia he polyelectrolyte nāwaliwali ka chitosan me ka pKa o 6.5. Hoʻopiʻi maikaʻi ʻia i loko o nā media acidic no ka mea ua protonated kona hui amino nui e nā ions hydrogen15. No laila, hoʻohana pinepine ʻia ia ma ke ʻano he mea lawe e hoʻopuni i nā macromolecules i hoʻopiʻi maikaʻi ʻole ʻia. Ma kēia haʻawina, ua hoʻohana ʻia ka chitosan e hoʻopuni i ka insulin me kahi kiko isoelectric o 5.3. ʻOiai ua hoʻohana ʻia ka chitosan ma ke ʻano he mea uhi, me ka hoʻonui ʻana o kona ʻāpana, piʻi like ka mānoanoa o ka papa waho o nā nanoparticles, e hopena ana i ka nui o ka nui o ka ʻāpana. Eia kekahi, hiki i nā pae kiʻekiʻe o ka chitosan ke hoʻopuni i ka insulin hou aku. I ko mākou hihia, ʻoi aku ka kiʻekiʻe o EE i ka wā i hiki ai ka ratio o chitosan a me ka insulin i 2.5: 1, a ʻaʻohe loli koʻikoʻi ma EE i ka wā i hoʻomau ai ka hoʻonui ʻana o ka ratio.
Ma waho aʻe o ka lakio o ka chitosan a me ka insulin, ua hoʻokani pū ka pH i kahi kuleana koʻikoʻi i ka hoʻomākaukau ʻana o nā NP. Ua aʻo ʻo Gan et al. 17 i ka hopena o ka pH ma ka nui o nā ʻāpana o nā nanoparticles chitosan. Ua ʻike lākou i ka emi mau ʻana o ka nui o nā ʻāpana a hiki i ka pH i ka 6.0, a ua ʻike ʻia ka piʻi nui ʻana o ka nui o nā ʻāpana ma ka pH > 6.0, kahi mea e kūlike me kā mākou mau nānā ʻana. ʻO kēia hanana ma muli o ka ʻoiaʻiʻo me ka hoʻonui ʻana o ka pH, loaʻa i ka molekala insulin kahi uku ʻili maikaʻi ʻole, no laila, e makemake ana i nā pilina electrostatic me ka hui chitosan/sodium tripolyphosphate (TPP), e hopena ana i ka nui o nā ʻāpana liʻiliʻi a me ka EE kiʻekiʻe. Eia naʻe, i ka wā i hoʻoponopono ʻia ai ka pH i 6.5, ua deprotonated nā hui amino ma chitosan, e hopena ana i ka pelu ʻana o chitosan. No laila, ʻo ka pH kiʻekiʻe ka hopena o ka emi ʻana o ka ʻike ʻana o nā ion amino i ka TPP a me ka insulin, e hopena ana i ka cross-linking haʻahaʻa, ka nui o ka nui o nā ʻāpana awelika hope loa a me ka EE haʻahaʻa.
ʻO ka nānā ʻana i nā waiwai morphological o nā NP maloʻo a me nā NP i pīpī ʻia e alakaʻi i ke koho ʻana i nā ʻano hana dehydration a me ka pauka maikaʻi. Pono ke ʻano makemake e hāʻawi i ka paʻa o ka lāʻau, ke ʻano like o nā ʻāpana, ka hoʻouka ʻana i nā lāʻau lapaʻau kiʻekiʻe a me ka solubility maikaʻi i ka hopena mua. Ma kēia haʻawina, no ka hoʻohālikelike maikaʻi ʻana i nā ʻano hana ʻelua, ua hoʻohana ʻia nā NP insulin me ka ʻole o 1% mannitol i ka wā dehydration. Hoʻohana ʻia ʻo Mannitol ma ke ʻano he mea hoʻonui a i ʻole cryoprotectant i nā ʻano pauka maloʻo like ʻole no ka maloʻo hau a me ka maloʻo ʻana o ka pīpī. No nā nanoparticles insulin lyophilized me ka ʻole o ka mannitol, e like me ka mea i hōʻike ʻia ma ke Kiʻi 2a, ua ʻike ʻia kahi ʻano pauka porous kiʻekiʻe me nā ʻili nui, ʻano ʻole a ʻinoʻino ma lalo o ka microscopy electron scanning (SEM). Ua ʻike ʻia kekahi mau ʻāpana discrete i loko o ka pauka ma hope o ka dehydration (Kiʻi 2e). Ua hōʻike kēia mau hopena ua hoʻopau ʻia ka hapa nui o nā NP i ka wā maloʻo hau me ka ʻole o ka cryoprotectant. No nā nanoparticles insulin maloʻo a me ka pīpī i loaʻa ka 1% mannitol, ua ʻike ʻia nā nanoparticles spherical me nā ʻili laumania (Kiʻi 1). 2b,d,f,h). Ua noho poepoe nā nanoparticles insulin i pīpī ʻia me ka ʻole o ka mannitol akā ua ʻāwili ʻia ma luna o ka ʻili (Kiʻi 2c). Ua kūkākūkā hou ʻia nā ʻili poepoe a me nā ʻili ʻāwili ʻia i loko o ke ʻano hoʻokuʻu a me nā hoʻāʻo lawe ʻana o ke kelepona ma lalo nei. Ma muli o ke ʻano ʻike ʻia o nā NP maloʻo, ʻo nā NP i pīpī ʻia me ka ʻole o ka mannitol a me nā NP i maloʻo ʻia me ka hau a me ka pīpī ʻia me ka mannitol i hua mai i nā pauka NP maikaʻi (Kiʻi 2f,g,h). ʻO ka nui o ka ʻili ma waena o nā ʻili ʻāpana, ʻoi aku ka kiʻekiʻe o ka solubility a no laila ʻoi aku ka kiʻekiʻe o ka helu hoʻokuʻu.
ʻAno o nā ʻano insulin NP maloʻo like ʻole: (a) kiʻi SEM o nā insulin NP lyophilized me ka ʻole o ka mannitol; (b) kiʻi SEM o nā insulin NP lyophilized me ka mannitol; (c) nā insulin NP maloʻo me ka ʻole o ka mannitol kiʻi SEM o; (d) kiʻi SEM o nā insulin NP i maloʻo me ka mannitol; (e) kiʻi o ka pauka insulin NP lyophilized me ka ʻole o ka mannitol; (f) kiʻi o nā insulin NP lyophilized me ka mannitol; (g) kiʻi o ka pauka insulin NP sprayed me ka ʻole o ka mannitol; (h) kiʻi o ka pauka insulin NP sprayed me ka mannitol.
I ka wā o ka maloʻo ʻana o ka hau, hana ka mannitol ma ke ʻano he cryoprotectant, e mālama ana i nā NP i loko o ke ʻano amorphous a pale i ka hōʻino ʻia e nā kristal hau19. I ka hoʻohālikelike ʻana, ʻaʻohe hana hau i ka wā o ka maloʻo ʻana o ka pīpī. No laila, ʻaʻole pono ka mannitol i kēia ʻano hana. ʻO ka ʻoiaʻiʻo, ua hua mai nā NP maloʻo me ka ʻole o ka mannitol i nā NP maikaʻi e like me ka mea i wehewehe mua ʻia. Eia nō naʻe, hiki i ka mannitol ke hana ma ke ʻano he mea hoʻopiha i ke kaʻina hana maloʻo e hāʻawi i nā NP i kahi ʻano poepoe hou aʻe20 (Kiʻi 2d), kahi e kōkua ai i ka loaʻa ʻana o ke ʻano hoʻokuʻu like o ia mau NP i hoʻopuni ʻia. Eia kekahi, ua maopopo he hiki ke ʻike ʻia kekahi mau ʻāpana nui i nā NP insulin maloʻo a me ka pīpī i loaʻa ka mannitol (Kiʻi 2b,d), hiki ke kumu o ka hōʻiliʻili ʻana o ka mannitol i loko o ka ʻōpū o ka ʻāpana me ka insulin i hoʻopuni ʻia. I. Papa Chitosan. He mea kūpono ke hoʻomaopopo ʻana ma kēia haʻawina, i mea e hōʻoia ai e mau ana ke ʻano poepoe ma hope o ka dehydration, mālama ʻia ka lakio o ka mannitol a me ka chitosan ma 5:1, i hiki ai i ka nui o ka mea hoʻopihapiha ke hoʻonui i ka nui o nā ʻāpana o nā NP maloʻo..
Ua hōʻike ʻia ka Fourier transform infrared attenuated total reflection (FTIR-ATR) spectroscopy i ka hui kino o ka insulin manuahi, chitosan, chitosan, TPP a me ka insulin. Ua hōʻike ʻia nā NP dehydrated āpau ma ka hoʻohana ʻana i ka FTIR-ATR spectroscopy. ʻIke ʻia, ua ʻike ʻia nā ikaika o ka band o 1641, 1543 a me 1412 cm-1 i loko o nā NP i hoʻopaʻa ʻia i maloʻo me ka mannitol a ma nā NP i pīpī ʻia me ka ʻole o ka mannitol (Kiʻi 3). E like me ka mea i hōʻike mua ʻia, ua pili kēia mau hoʻonui i ka ikaika me ka cross-linking ma waena o chitosan, TPP a me ka insulin. Ua hōʻike ʻia ka noiʻi ʻana o ka pilina ma waena o chitosan a me ka insulin i loko o nā spectra FTIR o nā nanoparticles chitosan i hoʻouka ʻia e ka insulin, ua uhi ka band chitosan me ko ka insulin, e hoʻonui ana i ka ikaika carbonyl (1641 cm-1) a me ka amine (1543 cm-1) kāʻei. Hoʻopili ʻia nā hui tripolyphosphate o TPP i nā hui ammonium i loko o chitosan, e hana ana i kahi band. ma 1412 cm-1.
Nā spectra FTIR-ATR o ka insulin manuahi, chitosan, nā hui kino o chitosan/TPP/insulin a me NPs i hoʻomaloʻo ʻia e nā ʻano hana like ʻole.
Eia kekahi, kūlike kēia mau hopena me nā mea i hōʻike ʻia ma SEM, kahi i hōʻike ai ua noho paʻa nā NP i hoʻopuni ʻia i ka wā i pīpī ʻia a maloʻo ʻia me ka mannitol, akā i ka loaʻa ʻole o ka mannitol, ʻo ka hoʻomaloʻo ʻana wale nō ka mea i hana i nā ʻāpana i hoʻopuni ʻia. I ka hoʻohālikelike ʻana, ua like loa nā hopena spectral FTIR-ATR o nā NP i hoʻomaloʻo ʻia me ka ʻole o ka mannitol me ka hui kino o chitosan, TPP, a me ka insulin. Hōʻike kēia hopena ʻaʻole i loaʻa hou nā loulou kea ma waena o chitosan, TPP a me ka insulin i nā NP i hoʻomaloʻo ʻia me ka ʻole o ka mannitol. Ua luku ʻia ke ʻano o NP i ka wā o ka hoʻomaloʻo ʻana me ka ʻole o ka cryoprotectant, hiki ke ʻike ʻia ma nā hopena SEM (Kiʻi 2a). Ma muli o ke ʻano a me nā hopena FTIR o nā NP insulin dehydrated, ʻo nā NP lyophilized, spray-dried, a me mannitol-free wale nō i hoʻohana ʻia no nā hoʻokolohua reconstitution a me nā NP mannitol-free ma muli o ka decomposition o nā NP mannitol-free i ka wā dehydration. kūkākūkā.
Hoʻohana ʻia ka dehydration no ka mālama ʻana i ka wā lōʻihi a me ka hana hou ʻana i nā ʻano hana ʻē aʻe. ʻO ka hiki o nā NP maloʻo ke hana hou ma hope o ka mālama ʻana he mea koʻikoʻi ia no kā lākou hoʻohana ʻana i nā ʻano hana like ʻole e like me nā papa a me nā kiʻiʻoniʻoni. Ua ʻike mākou ua piʻi iki ka nui o nā ʻāpana o nā NP insulin i hoʻomaloʻo ʻia i ka wā ʻaʻohe mannitol ma hope o ka hana hou ʻana. Ma ka ʻaoʻao ʻē aʻe, ua piʻi nui ka nui o nā ʻāpana o nā nanoparticles insulin i hoʻomaloʻo ʻia a me ka hau me ka mannitol (Papa 1). ʻAʻole i loli nui ʻia ka PDI a me EE (p > 0.05) ma hope o ka hui hou ʻana o nā NP āpau i kēia haʻawina (Papa 1). Hōʻike kēia hopena ua noho paʻa ka hapa nui o nā ʻāpana ma hope o ka hoʻoheheʻe hou ʻana. Eia nō naʻe, ʻo ka hoʻohui ʻana o ka mannitol ua hopena i ka emi nui ʻana o ka hoʻouka ʻana o ka insulin o nā nanoparticles mannitol lyophilized a me ka hoʻomaloʻo ʻia (Papa 1). I ka hoʻohālikelike ʻana, ua like ka nui o ka ukana insulin o nā NP i hoʻomaloʻo ʻia me ka ʻole o ka mannitol me ka wā ma mua (Papa 1).
Ua ʻike maopopo ʻia he mea koʻikoʻi ka hoʻouka ʻana o nā nanoparticles i ka wā e hoʻohana ʻia ai no nā kumu lawe lāʻau. No nā NP me nā ukana haʻahaʻa, pono nā nui o nā mea e hiki ai i ka paepae therapeutic. Eia nō naʻe, ʻo ke kiʻekiʻe o ka viscosity o ia mau ʻano NP kiʻekiʻe e alakaʻi ai i ka pilikia a me ka paʻakikī i ka lawelawe waha a me nā ʻano injectable, kēlā me kēia 22. Eia kekahi, hiki ke hoʻohana ʻia nā NP insulin e hana i nā papa a me nā biofilms viscous23, 24, kahi e koi ai i ka hoʻohana ʻana i nā nui o nā NP ma nā pae hoʻouka haʻahaʻa, e hopena ana i nā papa nui a me nā biofilms mānoanoa ʻaʻole kūpono no nā noi waha. No laila, makemake nui ʻia nā NP dehydrated me ka ukana insulin kiʻekiʻe. Hōʻike kā mākou mau hopena e hiki i ka ukana insulin kiʻekiʻe o nā NP spray-dried me ka ʻole mannitol ke hāʻawi i nā pono hoihoi he nui no kēia mau ʻano lawe ʻē aʻe.
Ua mālama ʻia nā NP maloʻo a pau i loko o ka friji no ʻekolu mahina. Ua hōʻike nā hopena SEM ʻaʻole i loli nui ke ʻano o nā NP maloʻo a pau i ka wā o ka mālama ʻana i ʻekolu mahina (Kiʻi 4). Ma hope o ka hoʻohui hou ʻana i ka wai, ua hōʻike nā NP a pau i kahi emi iki o ka EE a ua hoʻokuʻu ʻia ma kahi o kahi liʻiliʻi (~5%) o ka insulin i ka wā mālama ʻekolu mahina (Papa 2). Eia naʻe, ua piʻi ka nui o nā ʻāpana a pau o nā nanoparticles. Ua piʻi ka nui o nā ʻāpana o nā NP i hoʻomaloʻo ʻia me ka ʻole o ka mannitol i 525 nm, ʻoiai ʻo ka nui o nā NP i hoʻomaloʻo ʻia me ka ʻole o ka mannitol ua piʻi i 872 a me 921 nm, kēlā me kēia (Papa 2).
ʻAno o nā ʻano like ʻole o ka insulin NP maloʻo i mālama ʻia no ʻekolu mahina: (a) Kiʻi SEM o nā NP insulin lyophilized me ka mannitol; (b) Kiʻi SEM o nā nanoparticles insulin i pīpī ʻia me ka ʻole o ka mannitol; (c) me ka ʻole o ka mannitol Nā kiʻi SEM o nā NP insulin i pīpī ʻia.
Eia kekahi, ua ʻike ʻia nā precipitates i loko o nā nanoparticles insulin i hoʻoulu hou ʻia i hoʻomaloʻo ʻia me ka mannitol a maloʻo-hau (Fig. S2). Hiki ke hana ʻia kēia e nā ʻāpana nui i kau pono ʻole ʻia i loko o ka wai. Hōʻike nā hopena a pau i luna e hiki i ke ʻano hoʻomaloʻo ʻana i ka wai ke pale i nā nanoparticles insulin mai ka dehydration a hiki ke loaʻa nā ukana kiʻekiʻe o nā nanoparticles insulin me ka ʻole o nā mea hoʻopihapiha a i ʻole nā ​​cryoprotectants.
Ua hoʻāʻo ʻia ka paʻa ʻana o ka insulin ma ka pH = 2.5 medium me ka pepsin, trypsin, a me α-chymotrypsin e hōʻike i ka hiki ke pale o nā NP e kūʻē i ka ʻai ʻana o ka enzymatic ma hope o ka dehydration. Ua hoʻohālikelike ʻia ka paʻa ʻana o ka insulin o nā NP dehydrated me nā NP i hoʻomākaukau hou ʻia, a ua hoʻohana ʻia ka insulin manuahi ma ke ʻano he kaohi maikaʻi ʻole. Ma kēia haʻawina, ua hōʻike ka insulin manuahi i ka hoʻopau wikiwiki ʻana o ka insulin i loko o 4 h i nā lāʻau enzymatic ʻekolu (Kiʻi 5a-c). I ka hoʻohālikelike ʻana, ʻo ka hoʻāʻo ʻana e hoʻopau i ka insulin o nā NP i maloʻo me ka mannitol a me nā NP i pīpī ʻia me ka mannitol a i ʻole me ka ʻole o ka mannitol i hōʻike i ka pale kiʻekiʻe o kēia mau NP e kūʻē i ka ʻai ʻana o ka enzymatic, kahi like me nā NP insulin i hoʻomākaukau hou ʻia (kiʻi 1).5a-c). Me ke kōkua o nā nanoparticles i loko o ka pepsin, trypsin, a me α-chymotrypsin, ʻoi aku ma mua o 50%, 60%, a me 75% o ka insulin i hiki ke pale ʻia i loko o 4 h, kēlā me kēia (Kiʻi 5a-c). Hiki i kēia hiki ke pale aku i ka insulin. hoʻonui i ka manawa kūpono o ka omo ʻana o ka insulin i loko o ke koko25. Hōʻike kēia mau hopena e hiki i ka hoʻomaloʻo ʻana me ka mannitol a i ʻole me ka ʻole o ka mannitol a me ka hoʻomaloʻo hau me ka mannitol ke mālama i ka hiki ke pale aku i ka insulin o nā NP ma hope o ka maloʻo ʻana.
Ka pale ʻana a me ke ʻano hoʻokuʻu ʻana o nā NP insulin maloʻo: (a) ka pale ʻana o ka insulin i loko o ka hopena pepsin; (b) ka pale ʻana o ka insulin i loko o ka hopena trypsin; (c) ka pale ʻana o ka insulin e ka hopena α-chymotrypsin; (d) Ke ʻano hoʻokuʻu ʻana o nā NP maloʻo i ka hopena pH = 2.5; (e) ke ʻano hoʻokuʻu ʻana o nā NP maloʻo i ka hopena pH = 6.6; (f) ke ʻano hoʻokuʻu ʻana o nā NP maloʻo i ka hopena pH = 7.0.
Ua hoʻomoʻa ʻia nā NP insulin maloʻo i hoʻomākaukau hou ʻia a hoʻohui hou ʻia i loko o nā buffers like ʻole (pH = 2.5, 6.6, 7.0) ma 37 °C, e hoʻohālike ana i ke kaiapuni pH o ka ʻōpū, duodenum, a me ka ʻōpū liʻiliʻi o luna, e nānā i ka hopena o ka insulin ma ke kūʻē ʻana o ka insulin. ʻO ke ʻano hoʻokuʻu i nā wahi like ʻole. ʻĀpana o ke ala gastrointestinal. Ma ka pH = 2.5, ua hōʻike nā NP i hoʻouka ʻia e ka insulin a me nā NP insulin maloʻo i hoʻokuʻu ʻia i kahi hoʻokuʻu pahū mua i loko o hoʻokahi hola mua, a ukali ʻia e kahi hoʻokuʻu lohi i nā hola 5 e hiki mai ana (Kiʻi 5d). ʻO kēia hoʻokuʻu wikiwiki i ka hoʻomaka ʻana ʻo ia ka hopena o ka desorption wikiwiki o ka ʻili o nā molekala protein ʻaʻole i hoʻopaʻa piha ʻia i loko o ke ʻano kūloko o ka ʻāpana. Ma ka pH = 6.5, ua hōʻike nā NP i hoʻouka ʻia e ka insulin a me nā NP insulin maloʻo i hoʻoponopono hou ʻia i kahi hoʻokuʻu mālie a lohi ma luna o 6 h, ʻoiai ua like ka pH o ka hopena hoʻāʻo me ka hopena i hoʻomākaukau ʻia e ka NP (Kiʻi 5e). Ma ka pH = 7, ua paʻa ʻole nā ​​NP a ua aneane pau loa i loko o nā hola ʻelua mua (Kiʻi 5f). ʻO kēia no ka mea e hana ʻia ka deprotonation o chitosan ma ka pH kiʻekiʻe, kahi e hopena ai i kahi pūnaewele polymer liʻiliʻi a me ka hoʻokuʻu ʻana o ka insulin i hoʻouka ʻia.
Eia kekahi, ua hōʻike nā NP insulin i hoʻomaloʻo ʻia me ka ʻole o ka mannitol i kahi ʻano hoʻokuʻu wikiwiki ma mua o nā NP dehydrated ʻē aʻe (Kiʻi 5d–f). E like me ka mea i wehewehe mua ʻia, ua hōʻike nā NP insulin i hoʻopili hou ʻia i hoʻomaloʻo ʻia me ka ʻole o ka mannitol i ka nui o ka ʻāpana liʻiliʻi loa. Hāʻawi nā ʻāpana liʻiliʻi i kahi ʻili nui aʻe, no laila ʻo ka hapa nui o ka lāʻau lapaʻau pili e kokoke ana i ka ʻili o ka ʻāpana, e hopena ana i ka hoʻokuʻu wikiwiki ʻana o ka lāʻau26.
Ua noiʻi ʻia ka cytotoxicity o nā NP e ka MTT assay. E like me ka mea i hōʻike ʻia ma ke Kiʻi S4, ʻaʻohe hopena koʻikoʻi o nā NP dehydrated āpau i ke ola o nā cell ma nā ʻano o 50-500 μg/ml, e hōʻike ana e hiki ke hoʻohana palekana ʻia nā NP dehydrated āpau e hiki ai i ka puka makani therapeutic.
ʻO ke akepaʻa ke kino nui e hoʻokō ai ka insulin i kāna mau hana physiological. ʻO nā cell HepG2 kahi laina cell hepatoma kanaka i hoʻohana pinepine ʻia ma ke ʻano he kumu hoʻohālike lawe hepatocyte in vitro. Maanei, ua hoʻohana ʻia nā cell HepG2 e loiloi i ka lawe ʻana o ke kelepona o nā NP i hoʻomaloʻo ʻia me ka hoʻohana ʻana i ka hoʻomaloʻo hau a me nā ʻano hoʻomaloʻo pīpī. ʻO ka lawe ʻana o ke kelepona ma o ka nānā ʻana i ka laser confocal me ka hoʻohana ʻana i ka cytometry kahe a me ka ʻike ma hope o kekahi mau hola o ka incubation me ka insulin FITC manuahi ma kahi ʻano o 25 μg / mL, nā NP i hoʻouka ʻia e ka insulin FITC hou a me nā NP i hoʻouka ʻia e ka insulin FITC i hoʻomaloʻo ʻia ma nā ʻano insulin like. Ua hana ʻia nā nānā ʻana o ka microscopy quantitative (CLSM). Ua luku ʻia nā NP Lyophilized me ka ʻole o ka mannitol i ka wā o ka dehydration a ʻaʻole i loiloi ʻia i kēia hoʻāʻo. ʻO ka ikaika fluorescence intracellular o nā NP i hoʻouka ʻia e ka insulin hou, nā NP lyophilized me ka mannitol, a me nā NP i hoʻomaloʻo ʻia me ka ʻole o ka mannitol (Kiʻi 6a) he 4.3, 2.6, 2.4, a me 4.1-fold kiʻekiʻe ma mua o nā mea manuahi.Hui FITC-insulin, kēlā me kēia (Kiʻi 6b).Hōʻike kēia mau hopena he ʻoi aku ka ikaika o ka insulin i hoʻopuni ʻia i ka lawe ʻana o ke kelepona ma mua o ka insulin manuahi, ʻoiai ma muli o ka liʻiliʻi o ka nui o nā nanoparticles i hoʻouka ʻia e ka insulin i hana ʻia ma ke aʻo ʻana.
Ka lawe ʻana o nā pūnaewele HepG2 ma hope o 4 h incubation me nā NP i hoʻomākaukau hou ʻia a me nā NP maloʻo: (a) Ka hoʻolaha ʻana o ka lawe ʻana o ka FITC-insulin e nā pūnaewele HepG2.(b) ʻO ke awelika geometric o nā ikaika fluorescence i kālailai ʻia e ka cytometry kahe (n = 3), *P < 0.05 i hoʻohālikelike ʻia me ka insulin manuahi.
Pēlā nō, ua hōʻike nā kiʻi CLSM ua ʻoi aku ka ikaika o ka FITC fluorescence intensities o nā FITC-insulin-loaded NPs i hoʻomākaukau hou ʻia a me nā FITC-insulin-loaded spray-dried NPs (me ka ʻole o ka mannitol) ma mua o nā laʻana ʻē aʻe (Kiʻi 6a). Eia kekahi, me ka hoʻohui ʻana o ka mannitol, ʻo ke kiʻekiʻe o ka viscosity o ka hopena i hoʻonui i ke kūʻē ʻana i ka lawe ʻana o ke kelepona, e hopena ana i ka emi ʻana o ka hoʻonui ʻana o ka insulin. Hōʻike kēia mau hopena ua hōʻike nā NPs i hoʻomaloʻo ʻia me ka ʻole o ka mannitol i ka pono lawe ʻana o ke kelepona kiʻekiʻe loa no ka mea ʻoi aku ka liʻiliʻi o ko lākou nui o ka ʻāpana ma mua o nā NPs i hoʻomaloʻo ʻia ma hope o ka hoʻoheheʻe hou ʻana.
Ua kūʻai ʻia ʻo Chitosan (ʻawelike kaumaha molekala 100 KDa, 75–85% deacetylated) mai Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Kanada). Ua kūʻai ʻia ʻo Sodium tripolyphosphate (TPP) mai VWR (Radnor, Pennsylvania, USA). ʻO ka insulin kanaka recombinant i hoʻohana ʻia ma kēia haʻawina mai Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Ua kūʻai ʻia ka insulin kanaka i kapa ʻia ʻo Fluorescein isothiocyanate (FITC) a me 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) mai Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Kanada). Ua loaʻa ka laina cell HepG2 mai ATCC (Manassas, Virginia, USA). ʻO nā reagents ʻē aʻe a pau he analytical a chromatographic paha.
E hoʻomākaukau i kahi hopena CS 1 mg/ml ma ka hoʻoheheʻe ʻana i loko o ka wai distilled pālua (wai DD) me 0.1% acetic acid. E hoʻomākaukau i nā hopena 1 mg/ml o TPP a me ka insulin ma ka hoʻoheheʻe ʻana iā lākou i loko o ka wai DD a me 0.1% acetic acid, kēlā me kēia. Ua hoʻomākaukau ʻia ka pre-emulsion me kahi polytron PCU-2-110 high speed homogenizer (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Penei ke kaʻina hana hoʻomākaukau: ʻo ka mea mua, ua hoʻohui ʻia ka 2ml o ka hopena TPP i ka 4ml o ka hopena insulin, a ua hoʻoulu ʻia ka hui no 30min a ua hui piha ʻia. A laila, ua hoʻohui ʻia ka hopena i hui ʻia i ka hopena CS ma o kahi syringe ma lalo o ka hoʻoulu wikiwiki (10,000 rpm). Ua mālama ʻia nā hui ma lalo o ka hoʻoulu wikiwiki (15,000 rpm) i loko o kahi ʻauʻau hau no 30 min, a ua hoʻoponopono ʻia i kahi pH e loaʻa ai nā NP insulin cross-linked. No ka homogenize hou a hoʻemi i ka nui o nā ʻāpana o nā NP insulin, ua ua sonicated ʻia no kekahi 30 min hou aʻe i loko o kahi ʻauʻau hau me ka hoʻohana ʻana i kahi sonicator ʻano probe (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Kelemania).
Ua hoʻāʻo ʻia ka Insulin NPS no ke anawaena Z-awelike, ka helu polydispersity (PDI) a me ka zeta potential me ka hoʻohana ʻana i nā ana hoʻopuehu mālamalama dynamic (DLS) me ka hoʻohana ʻana i ka Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) ma ka hoʻoheheʻe ʻana iā lākou i ka wai DD ma 25°C. Ua wehewehe ʻia ke ʻano a me ka hoʻolaha nui e kahi microscope electron transmission Hitachi H7600 (TEM) (Hitachi, Tokyo, Iapana), a ua kālailai ʻia nā kiʻi ma hope me ka hoʻohana ʻana i ka polokalamu kiʻi Hitachi (Hitachi, Tokyo, Iapana). No ka loiloi ʻana i ka pono encapsulation (EE) a me ka hiki ke hoʻouka (LC) o nā NP insulin, ua pipetted ʻia nā NP i loko o nā ʻōmole ultrafiltration me kahi ʻoki kaumaha molekala o 100 kDa a centrifuged ma 500 xg no 30 min. Ua helu ʻia ka insulin i hoʻopaʻa ʻole ʻia i loko o ka filtrate me ka hoʻohana ʻana i kahi ʻōnaehana Agilent 1100 Series HPLC (Agilent, Santa Clara, Kaleponi, USA) i haku ʻia me kahi pamu quaternary, autosampler, kolamu. mea hoʻomehana, a me ka mea ʻike DAD. Ua kālailai ʻia ka insulin e kahi kolamu C18 (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, USA) a ua ʻike ʻia ma 214 nm. ʻO ka pae mobile he acetonitrile a me ka wai, nona ka 0.1% TFA, nā lakio gradient mai 10/90 a i 100/0, a holo no 10 mau minuke. Ua pamu ʻia ka pae mobile ma kahi kahe o 1.0 ml/min. Ua hoʻonohonoho ʻia ka mahana o ke kolamu i 20 °C. E helu i nā pakeneka o EE a me LC me ka hoʻohana ʻana i nā kaulike. (1) a me Eq. (2).
Ua hoʻāʻo ʻia nā lakio CS/insulin like ʻole mai 2.0 a 4.0 e hoʻomaikaʻi i ka insulin NP. Ua hoʻohui ʻia nā nui like ʻole o ka hopena CS i ka wā o ka hoʻomākaukau ʻana, ʻoiai ua mālama mau ʻia ka hui insulin/TPP. Ua hoʻomākaukau ʻia nā NP Insulin ma ka pae pH o 4.0 a 6.5 ma ka hoʻomalu pono ʻana i ka pH o ka hui ma hope o ka hoʻohui ʻana i nā hopena āpau (insulin, TPP a me CS). Ua loiloi ʻia ka EE a me ka nui o nā ʻāpana o nā nanoparticles insulin ma nā waiwai pH like ʻole a me nā lakio nuipa CS/insulin e hoʻomaikaʻi i ka hoʻokumu ʻia ʻana o nā NP insulin.
Ua kau ʻia nā NP insulin i hoʻomaikaʻi ʻia ma luna o ka pahu alumini a uhi ʻia me nā ʻiʻo i hoʻopaʻa ʻia me kekahi lipine. Ma hope iho, ua kau ʻia nā pahu i wili ʻia i loko o kahi mea hoʻomaloʻo hau Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) i lako me kahi mea hoʻomaloʻo pā. Ua hoʻonohonoho ʻia ka mahana a me ke kaomi vacuum ma -10 °C, 0.350 Torr no nā hola 2 mua, a me 0 °C a me 0.120 Torr no nā hola 22 i koe o nā hola 24 e loaʻa ai nā NP insulin maloʻo.
Ua hoʻohana ʻia ʻo Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Switzerland) e hana i ka insulin i hoʻopuni ʻia. ʻO nā palena hoʻomaloʻo i koho ʻia: mahana 100 °C, kahe hānai 3 L/min, a me ke kahe kinoea 4 L/min.
Ua wehewehe ʻia nā NP Insulin ma mua a ma hope o ka dehydration me ka hoʻohana ʻana i ka spectroscopy FTIR-ATR. Ua kālailai ʻia nā nanoparticles dehydrated a me ka insulin manuahi a me ka chitosan me ka hoʻohana ʻana i kahi spectrophotometer Spectrum 100 FTIR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) i lako me kahi mea hoʻohui laʻana ATR honua (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Ua loaʻa nā awelika hōʻailona mai 16 mau scan ma kahi hoʻonā o 4 cm2 ma ka laulā alapine o 4000-600 cm2.
Ua loiloi ʻia ke ʻano o nā NP insulin maloʻo e nā kiʻi SEM o nā NP insulin maloʻo-hau a me nā NP insulin i pīpī ʻia i hopu ʻia e kahi Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, USA). ʻO ke ʻano nui i hoʻohana ʻia, ʻo ia ka uila 5 keV a me ke au o 30 mA.
Ua hoʻoheheʻe hou ʻia nā NP insulin maloʻo a pau i loko o ka wai dd. Ua hoʻāʻo hou ʻia ka nui o ka ʻāpana, PDI, EE a me LC me ka hoʻohana ʻana i ke ʻano like i ʻōlelo ʻia ma mua e loiloi i ko lākou maikaʻi ma hope o ka maloʻo ʻana. Ua ana ʻia ke kūpaʻa o nā NP anhydroinsulin ma ka hoʻāʻo ʻana i nā waiwai o nā NP ma hope o ka mālama lōʻihi ʻana. Ma kēia haʻawina, ua mālama ʻia nā NP a pau ma hope o ka maloʻo ʻana i loko o ka friji no ʻekolu mahina. Ma hope o ʻekolu mahina o ka mālama ʻana, ua hoʻāʻo ʻia nā NP no ka nui o ka ʻāpana morphological, PDI, EE a me LC.
E hoʻoheheʻe i 5 mL o nā NP i hoʻoponopono hou ʻia i loko o 45 mL e loaʻa ana ka wai ʻōpū hoʻohālike (pH 1.2, nona ka 1% pepsin), ka wai ʻōpū (pH 6.8, nona ka 1% trypsin) a i ʻole ka hopena chymotrypsin (100 g/mL, i loko o ka phosphate buffer, pH 7.8) e loiloi i ka pono o ka insulin i ka pale ʻana i nā NP ma hope o ka dehydration. Ua hoʻomoʻa ʻia lākou ma 37°C me ka wikiwiki o ka hoʻoulu ʻana o 100 rpm. Ua hōʻiliʻili ʻia he 500 μL o ka hopena i nā manawa like ʻole a ua hoʻoholo ʻia ka nui o ka insulin e HPLC.
Ua hoʻāʻo ʻia ke ʻano hoʻokuʻu in vitro o nā NP insulin i hoʻomākaukau hou ʻia a maloʻo ʻia e ke ʻano ʻeke dialysis (molecular weight cut-off 100 kDa, Spectra Por Inc.). Ua dialyzed ʻia nā NP maloʻo i hoʻomākaukau hou ʻia a hoʻohui hou ʻia i loko o nā wai ma pH 2.5, pH 6.6, a me pH 7.0 (0.1 M phosphate-buffered saline, PBS) e hoʻohālike i ke kaiapuni pH o ka ʻōpū, duodenum, a me ka ʻōpū liʻiliʻi o luna. Ua hoʻomoʻa ʻia nā laʻana āpau ma 37 °C me ka lulu mau ʻana ma 200 rpm. E omo i ka wai ma waho o ka ʻeke dialysis 5 mL i nā manawa aʻe: 0.5, 1, 2, 3, 4, a me 6 h, a hoʻopiha koke i ka nui me ka dialysate hou. Ua kālailai ʻia ka haumia o ka insulin i loko o ka wai e HPLC, a ua helu ʻia ka wikiwiki o ka hoʻokuʻu ʻana o ka insulin mai nā nanoparticles mai ka lakio o ka insulin manuahi i hoʻokuʻu ʻia i ka insulin holoʻokoʻa i hoʻopili ʻia i loko o nā nanoparticles (Equation 3).
Ua ulu ʻia nā pūnaewele HepG2 o ka laina cell carcinoma hepatocellular kanaka i loko o nā kīʻaha 60 mm ke anawaena me ka hoʻohana ʻana i ka Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) nona ka 10% fetal bovine serum, 100 IU/mL penicillin, a me 100 μg/mL streptomycin29. Ua mālama ʻia nā moʻomeheu ma 37°C, 95% ka haʻahaʻa pili, a me 5% CO2. No nā hoʻāʻo uptake, ua lūlū ʻia nā pūnaewele HepG2 ma 1 × 105 mau pūnaewele/ml ma luna o kahi ʻōnaehana slide chamber Nunc Lab-Tek 8-well (Thermo Fisher, NY, USA). No nā hoʻāʻo cytotoxicity, ua lūlū ʻia lākou i loko o nā pā 96-well (Corning, NY, USA) ma ka density o 5 × 104 mau pūnaewele/ml.
Ua hoʻohana ʻia ka hoʻāʻo MTT e loiloi i ka cytotoxicity o ka insulin NPs30 i hoʻomākaukau hou ʻia a maloʻo. Ua lūlū ʻia nā pūnaewele HepG2 i loko o nā pā 96-well ma kahi nui o 5 × 104 mau pūnaewele/mL a ua hoʻoulu ʻia no 7 mau lā ma mua o ka hoʻāʻo ʻana. Ua hoʻoheheʻe ʻia nā NP Insulin i nā ʻano like ʻole (50 a 500 μg/mL) i loko o ka medium culture a laila hāʻawi ʻia i nā pūnaewele. Ma hope o 24 mau hola o ka incubation, ua holoi ʻia nā pūnaewele i 3 mau manawa me PBS a ua hoʻoulu ʻia me ka medium e loaʻa ana he 0.5 mg/ml MTT no 4 mau hola hou aʻe. Ua loiloi ʻia ka Cytotoxicity ma ke ana ʻana i ka hoʻemi enzymatic o ka tetrazolium melemele MTT i ka formazan poni ma 570 nm me ka hoʻohana ʻana i kahi mea heluhelu pā spectrophotometer Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Switzerland).
Ua hoʻāʻo ʻia ka pono o ka lawe ʻana o nā NP i loko o ke kelepona e ka microscopy scanning laser confocal a me ka nānā ʻana o ka cytometry kahe. Ua mālama ʻia kēlā me kēia lua o ka ʻōnaehana slide keʻena Nunc Lab-Tek me ka FITC-insulin manuahi, FITC-insulin-loaded NPs, a ua hoʻohui hou ʻia he 25 μg/mL o nā FITC-insulin NPs dehydrated ma ka like like a ua hoʻomoʻa ʻia no 4 mau hola. Ua holoi ʻia nā cell i 3 mau manawa me PBS a hoʻopaʻa ʻia me 4% paraformaldehyde. Ua hoʻoluʻu ʻia nā nuclei me 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Ua ʻike ʻia ka localization insulin me ka hoʻohana ʻana i kahi microscope confocal scanning/ʻelua-photon Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Iapana). No ka nānā ʻana i ka cytometry kahe, ua hoʻohui ʻia nā ʻano like o 10 μg/mL FITC-insulin manuahi, FITC-insulin-loaded NPs, a me nā FITC-insulin NPs dehydrated resolubilized i nā papa 96-well i lūlū ʻia me nā cell HepG2 a ua hoʻomoʻa ʻia no. 4 hola. Ma hope o 4 hola o ka hoʻoulu ʻana, ua wehe ʻia nā pūnaewele a holoi ʻia i 3 mau manawa me FBS. Ua kālailai ʻia nā pūnaewele 5 × 104 no kēlā me kēia laʻana e kahi cytometer kahe BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, ʻAmelika Hui Pū ʻIa).
Ua hōʻike ʻia nā waiwai āpau ma ke ʻano he awelika ± ka ʻokoʻa maʻamau. Ua loiloi ʻia nā hoʻohālikelike ma waena o nā hui āpau me ka hoʻohana ʻana i ka ANOVA hoʻokahi ala a i ʻole t-test e IBM SPSS Statistics 26 no Mac (IBM, Endicott, New York, USA) a ua manaʻo ʻia he koʻikoʻi ka p <0.05.
Hōʻike kēia haʻawina i ka maʻalahi a me ka hiki o ka hoʻomaloʻo ʻana i ka wai e hoʻomaloʻo i nā nanoparticles chitosan/TPP/insulin i hoʻopili ʻia me ka hoʻoponopono hou ʻana i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻano hana hoʻomaloʻo hau maʻamau e hoʻohana ana i nā mea hana bulking a i ʻole ka hiki ke cryoprotectants a me ka hiki ke hoʻouka kiʻekiʻe. Ua hua mai nā nanoparticles insulin i hoʻomaikaʻi ʻia i ka nui o ka ʻāpana awelika o 318 nm a me ka pono encapsulation o 99.4%. Ua hōʻike nā hopena SEM a me FTIR ma hope o ka dehydration ua mālama ʻia ke ʻano spherical i nā NP i hoʻomaloʻo ʻia me ka ʻole o ka mannitol a me ka lyophilized me ka mannitol, akā ua hoʻopau ʻia nā NP lyophilized me ka ʻole o ka mannitol i ka wā dehydration. I ka hoʻāʻo hiki ke hoʻoponopono hou ʻana, ua hōʻike nā nanoparticles insulin i hoʻomaloʻo ʻia me ka ʻole o ka mannitol i ka liʻiliʻi loa o ka nui o ka ʻāpana a me ka ukana kiʻekiʻe loa ma luna o ka hoʻoponopono hou ʻana. Ua hōʻike nā ʻano hoʻokuʻu o kēia mau NP dehydrated āpau ua hoʻokuʻu koke ʻia lākou i nā hopena o ka pH = 2.5 a me ka pH = 7, a paʻa loa i ka hopena o ka pH = 6.5. Ke hoʻohālikelike ʻia me nā NP dehydrated ʻē aʻe i hoʻoheheʻe hou ʻia, nā NP Ua hōʻike ʻia ka hoʻomaloʻo ʻia me ka ʻole o ka mannitol i ka hoʻokuʻu wikiwiki loa. Kūlike kēia hopena me ka mea i ʻike ʻia ma ka hoʻāʻo lawe ʻana o ke kelepona, ʻoiai ʻo nā NP i hoʻomaloʻo ʻia me ka ʻole o ka mannitol ua mālama loa i ka pono lawe ʻana o ke kelepona o nā NP i hoʻomākaukau hou ʻia. Hōʻike kēia mau hopena he kūpono loa nā nanoparticles insulin maloʻo i hoʻomākaukau ʻia e ka hoʻomaloʻo ʻana me ka ʻole o ka mannitol no ka hana hou ʻana i nā ʻano dosage anhydrous ʻē aʻe, e like me nā papa waha a i ʻole nā ​​​​kiʻiʻoniʻoni bioadhesive.
Ma muli o nā pilikia waiwai noʻeau, ʻaʻole i loaʻa i ka lehulehu nā ʻikepili i hana ʻia a/a i ʻole i kālailai ʻia i ka wā o ke aʻo ʻana o kēia manawa, akā loaʻa mai nā mea kākau like ʻole ma ke noi kūpono.
ʻO Kagan, A. ʻO ka maʻi diabetes ʻano 2: nā kumu pilikanaka a me ka ʻepekema, nā pilikia olakino, a me nā hopena no nā maʻi a me nā poʻe ʻē aʻe. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Ka hoʻomohala ʻana o ka encapsulation insulin: hiki anei ke lawelawe waha i kēia manawa? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Nā holomua hou i nā ʻōnaehana hoʻouna liposome i hoʻouka ʻia e ka insulin waha no ka mālama ʻana i ka maʻi diabetes.Interpretation.J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).